目前尚无针对 PEDV 的有效药物，生物安全措施结合疫苗接种是最主要的防控手段。 现有商品化 PED 疫苗以传统灭活疫苗和弱毒疫苗为主，但由于 PEDV 基因型多且变异频率高，疫苗对变异毒株的免疫保护效果有待加强。近年来，基因工程疫苗因其良好的安全性和免疫效果而备受关注，目前已开发出亚单位疫苗、重组活载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、 转基因植物疫苗和核酸疫苗等。本文综述了 PEDV 病原学特征和 PED 疫苗的最新研究进展， 并对未来疫苗的发展进行展望，旨在为生产实践中有效防控 PED 提供参考。
1、 PEDV 基因组与 S 蛋白特征
PEDV 属于冠状病毒科 α 冠状病毒属，是有囊膜的单股正链 RNA 病毒。病毒粒子近似球形，粒子直径为 130-170 nm，表面由棒状突起覆盖。基因组全长约为 28 kb，包含 5’帽 子结构、3’poly (A)尾和 7 个开放阅读框（open reading frame，ORF）。其中 ORF1a 和 ORF1b 占据基因组的 2/3，编码非结构多聚蛋白 1a 和 1ab，这两种多聚蛋白在 3C 样蛋白酶 和类木瓜蛋白酶的作用下裂解为 16 种非结构蛋白（nonstructural protein，nsp）；另 1/3 基因组主要编码 4 种结构蛋白，分别为棘突蛋白 S、包膜蛋白 E、囊膜蛋白 M 和核衣壳蛋白 N。
S 蛋白是一种位于病毒表面的糖蛋白，通过与宿主细胞上的特异性受体结合介导病毒的入侵，并与病毒的组织或宿主嗜性相关。S 蛋白由两个亚基组成，分别是外部的 S1 亚基和内部的 S2 亚基。S1 亚基由 N 端信号肽、N 末端结构域和 C 末端结构域组成，负责与宿主细胞受体的结合。S2 亚基由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，负责介导病毒与宿主细胞膜的融合；其中，S2 亚基的胞外域包括蛋白酶切割位点、融合肽和两个七肽重复区。S 蛋白是 PEDV 重要的免疫原性蛋白，目前已经发现六个中和表位 S10（aa 19– 220）、S1A（aa 435–485），COE（aa 499–638）、SS2（aa 748–755)、SS6（aa 764–771） 和 2C10（aa 1368–1374）。因此，S 蛋白常被作为 PEDV 疫苗设计的关键靶点。
根据对 PEDV S 基因的遗传进化研究，PEDV 毒株可分为 GⅠ型和 GⅡ型，其中 GⅠ型又分为 GⅠa和GⅠb亚型，GⅡ型又分为GⅡa和GⅡb亚型。当前我国优势流行毒株为GⅡ变异型。 2014 年，美国首次分离到一株低致病性 PEDV-OH851 株，与其它 PEDV 流行毒株的 S 基因相比，OH851 株的 S 基因有 3 个缺失（167 位 1 nt 缺失，176 位 11 nt 缺失，416 位 3 nt 缺 失），1 个插入位点（474-475 位之间 6 nt 插入），S1 区前 1170 nt 有多个突变，这种新出现的毒株被命名为“S-INDEL”毒株。
2 PEDV 商品疫苗概况
2.1 PEDV 国内商品疫苗概况
2015 年 3 月 24 日，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的猪传染性胃肠炎病毒 （transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒 （porcine rotavirus，PoRV）三联活疫苗正式发布，这是中国大陆第一个猪腹泻病毒三联疫苗，能够同时预防三种主要的猪病毒性腹泻疾病。
目前，国内已有 30 余家生产企业获得 PEDV 疫苗的生产批准文号，其中以生产 TGEV、PEDV 二联疫苗居多，毒株以经典毒株 CV777 为主，但使用 GⅠ群经典毒株 CV777 研制的疫苗已经无法对当前流行的 GⅡ群毒株提供很好的免疫保护力，因此，近几年也陆续发布了针对 AJ1102 株（2017 年首次批签发）、SCSZ-1 株（2018 年首次批签发）、LW/L 株（2018 年首次批签发）、XJ-DB2 株 （2021 年首次批签发）和 CHYJ 株（2023 年首次批签发）等变异流行毒株的 PEDV 商品疫苗。
PEDV 主要感染肠道上皮细胞，通过胃肠道免疫激发乳腺分泌 sIgA 抗体，仔猪通过初 乳摄取 sIgA 抗体后可以获得针对 PEDV 的被动免疫保护，因此诱发有效的黏膜免疫是预防仔猪感染 PEDV 的关键。2023 年，由海大集团发布的海泻康-猪流行性腹泻灭活疫苗 （CHYJ 株）成为国内首个获批的腹泻类黏膜免疫疫苗，其推荐免疫方式为滴鼻免疫，突破了以往的注射免疫方式，为未来的 PEDV 疫苗研究提供了新的方向。2024 年国内批签发的 PEDV 商品疫苗种类包括猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗；猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联弱毒疫苗；猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联弱毒活疫苗和猪流行性腹泻灭活疫苗，采用的毒株包括 PEDV 经典毒株（CV777 株、ZJ-08 株） 和变异毒株（AJ1102-R 株、SCZ-1 株、LW/L 株、XJ-DB2 株、CHYJ 株）（表 1）。
2018-2023 年已获临床批件的疫苗数据表明（表 2），相比过去主要围绕猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联疫苗进行研发与生产，目前关于 PEDV 商品疫苗则主要围绕猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪 δ 冠状病毒三联灭活疫苗和猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗进行研发，所采用毒株已全部为 PEDV 流行变异毒株，这与当前临床病毒性腹泻的流行现状高度契合。亚单位疫苗具有便于规模化生产、安全性高、稳定性好的优点，首个由 CHO 细胞表达的 PEDV S 蛋白亚单位疫苗 CHO-3G12 株也已进入临床审批阶段。近几年获临床批件的 PEDV 相关疫苗类型代表了未来商品化猪腹泻疫苗的主要趋势，相信在未来能够为防控猪病毒性腹泻疾病提供更有力的保障。
2.2 国外商品疫苗概况
韩国于 1992年首次报道 PEDV，此后 PED在其许多省份流行，成为韩国最重要的猪病毒性腹泻疾病之一，并造成重大的经济损失。为了防控 PED，韩国第一种基于 GⅠa 型PEDV毒株SM98-1的灭活疫苗在2004年上市。该毒株还通过在细胞中连续传代培养致弱，用于制作弱毒疫苗。此外，韩国研究人员通过将分离得到的 PEDV 毒株在 Vero 细胞中连续传代获得 GⅠa 型 PEDV 减毒株 KPEDV-9 和 DR-13 并制成弱毒疫苗，两种疫苗的免疫途径分别为肌肉接种免疫和口服免疫。
3 PEDV 传统疫苗研究现状
3.1 灭活疫苗
早期的 PEDV 灭活疫苗是将病猪的小肠组织处理并灭活后加入佐剂制成，也称为组织灭活疫苗。国内最早报道的 PEDV 灭活疫苗就是 1993 年由王明等用 PEDV 沪毒株攻毒后取发病仔猪的肠组织悬液制成的氢氧化铝组织灭活疫苗。PEDV 组织灭活疫苗的制备方法较为简易，且具有较强的病原针对性；但通常难以确定组织中的病原含量，并含有很多异源物质和不确定因素，不易于大规模生产。相比之下，以病毒的细胞培养物制成的细胞灭活疫苗质量可控，还能基于细胞悬浮培养技术实现大规模生产，发展前景更为广阔。近五年在猪体内进行过动物试验的猪流行性腹泻灭活疫苗研究如表 3 所示。常小云等利用悬浮培养技术将 PEDV GF10 变异株制备成灭活苗免疫妊娠母猪，结果表明该疫苗对于仔猪的保护率高达 90%，且仔猪获得的母源抗体可持续至 35 日龄以上。郭振刚等用 PEDVGS 毒株细胞灭活苗免疫妊娠母猪，所产 7 日龄仔猪的母源抗体中和效价在 1：128~1：256之间，并且可持续至 28日龄左右。为简化疫苗开发工艺，Singh 等将 PEDV CO2013毒株在44℃条件下热处理10 min以展开结构蛋白，随后用RNAse使基因组片段化，最后在25℃下重新折叠衣壳蛋白以制备 PEDV 灭活苗，免疫 3 周龄仔猪可以提供针对 PEDV 强毒株的保护作用。使用胰蛋白酶依赖性的 PEDV 毒株作为疫苗毒株会使疫苗制备过程更复杂，并增加疫苗生产的成本。Li 等利用相应的 PEDV JS2008 毒株（非胰蛋白酶依赖型 PEDV GⅠ毒株）序列替换 PEDV AJ1102 毒株（胰蛋白酶依赖型 PEDV GⅡ毒株）的 S2 结构域（aa894-1386），生成重组毒株 rAJ1102-S2′JS2008。rAJ1102-S2′JS2008 可以独立于胰蛋白酶进行稳定传代，灭活后对 4 周龄仔猪进行三次肌肉注射可以诱导仔猪同时产生针对 AJ1102 和JS2008 毒株的中和抗体。
灭活疫苗具有安全性高、便于贮存和运输及生产工艺成熟等优点，但其免疫效果较差，无法诱导细胞免疫，需要多次接种才能达到持久的免疫效果。因此，灭活疫苗通常需要适当的免疫增强剂。Xu 等将 PEDV AH2012/12 毒株灭活后添加 Flic 佐剂制成灭活疫苗，对妊娠母猪间隔 14 d 进行两次滴鼻免疫后，母猪血清和初乳中均产生了高水平的 IgG、IgA和中和抗体，仔猪存活率提升了 73.34%。Hsueh 等使用 PEDV PT-5 毒株制成灭活疫苗后对 5 周龄仔猪进行肌肉注射，与未添加佐剂的灭活疫苗相比，使用 CCL 蛋白作为佐剂的灭活疫苗可诱导更高水平的特异性 IgG 和 sIgA 抗体。Choe 等用 PEDV SGP-M1 毒株混合Carbopol® 940 NF 聚合物制成灭活疫苗，在妊娠母猪分娩前 5 周和 2 周各皮下接种 1 次，可保护所产仔猪免受强毒株的攻击，仔猪存活率为 70%。建立肠黏膜免疫反应包括病毒特异性 IgA 的分泌，是预防 PEDV 感染的关键。Zhang 等研究发现，与口服免疫相比，滴鼻免疫 PEDV 灭活疫苗后仔猪肠道内中和抗体水平更高，表明滴鼻免疫在诱导肠黏膜免疫反应方面更有效，是一种很有潜力的灭活疫苗接种方式。
3.2 弱毒疫苗
随着 PEDV 基因组信息增多，利用基因工程技术敲减或敲除毒力基因获得弱毒株正成为 PEDV 弱毒疫苗的研究热点。与传统方法相比，该技术的安全性更高、研发过程更高效、生产工艺更简便。Hou 等通过抑制 nsp16 的 2′-O 甲基转移酶的活性并同时敲除 S 蛋白胞内域的内吞信号序列，设计了 PEDV KDKE4A-SYA 重组弱毒株，该毒株感染细胞可以诱导更强的 I 型和 III 型干扰素反应，免疫妊娠母猪后对新生仔猪的保护率可达 100%，表明nsp16 蛋白可以作为开发 PEDV 弱毒疫苗的通用靶标。Deng 等通过使 PEDV 中的干扰素11拮抗蛋白 nsp1、nsp15 和 nsp16 失活得到了弱毒株 icPEDV-mute4，仔猪感染该毒株后未表现相关症状，并且诱发了针对 PEDV 的 IgG 中和抗体反应，为研制 PEDV 弱毒疫苗提供了新的方向。冠状病毒 S 蛋白的 N-糖基化位点突变是影响哺乳动物冠状病毒感染，传播，致病性和免疫原性的关键因素。Zhang 等通过用天冬酰胺氨基酸替换 aa514 和 aa556 位点的丝氨酸，生成了三种重组 PEDV，分别命名为 r12-N514G、r12-N556G 和 r12-N514+556G。与亲本病毒相比，重组病毒可以诱导 5 日龄仔猪产生高水平的 sIgA 和 IgG 抗体，抗体滴度在 12 dpi 时达到峰值水平，其原因可能是去除糖基化位点会暴露 S 蛋白的抗原表位，以削弱病毒对宿主免疫反应的逃逸能力，但重组 PEDV 仍会引起组织病变，其安全性还有待考量。
与 PEDV 灭活疫苗相比，弱毒活疫苗具有更好的免疫原性，能够有效刺激肠道黏膜而产生黏膜免疫，并可以长期保持免疫效果，减少多次接种带来的猪群应激。但弱毒活疫苗的保存和运输条件较为严格，并具有返强风险。针对 2010 年后出现的 PEDV 变异毒株，基于经典毒株制备的商品化疫苗可能无法提供理想的保护效果。因此，基于基因工程的PEDV 新型疫苗研究正成为热点。
4 PEDV 基因工程疫苗研究现状
4.1 亚单位疫苗
BEVs可对目标蛋白进行恰当的折叠和翻译后修饰，从而使表达的蛋白接近天然蛋白，并且昆虫细胞可大规模悬浮培养，有利于规模化生产。吴松等利用BEVs表达了的PEDVCT 株的 S1 蛋白并制备亚单位疫苗，免疫妊娠 75 d 的母猪后，在母猪的血清和乳汁中分别能检测到高水平的 IgG 和 sIgA 抗体，对仔猪的保护率为 75.32%。Chang 等用家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori NPV，BmNPV）表达 PEDV PT 株的 S 蛋白后制成亚单位疫苗，对4 周龄仔猪间隔 2 周口服免疫 3 次后，不能检测到针对 PEDV 的特异性体液免疫反应和黏膜免疫反应，研究人员认为这可能是由于猪胃肠道的低 pH环境和消化酶酶解能力导致疫苗失活，以及疫苗未添加佐剂来克服口服耐受性，需要探究更好的策略来使口服疫苗在胃肠道递送并保留其免疫原性。Yu 等用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达 PEDV CO 株的 S 蛋白后制成亚单位疫苗，新生仔猪每两周肌肉注射两剂疫苗后可在血清检测到高滴度的中和抗体，但仔猪在 5 周龄受到 PEDV 强毒株攻击后表现出严重的腹泻症状。结果表明该亚单位疫苗可能会诱导宿主产生针对融合后 PEDV S 蛋白的非中和抗体，并产生抗体依赖增强效应。
基因工程亚单位疫苗可利用体外表达系统进行蛋白大量表达，便于规模化生产，具有安全性高、稳定性好的优点；同时还可配套病原体其他蛋白作为抗原建立诊断方法，以区分亚单位疫苗免疫和野毒感染。然而，与含有完整病原体成分的疫苗相比，亚单位疫苗的免疫原性较低，通常需要佐剂辅助来增强免疫效果。Wang等在 PEDV亚单位疫苗中添加复合佐剂 CpG5 和 MF59，对 30 日龄的仔猪肌肉免疫后，复合佐剂组仔猪的 IgG 抗体滴度明显高于单独使用两种佐剂的组别，表明 MF59 和 CpG5 的佐剂组合具有协同效应，可在PEDV 亚单位疫苗中产生更强烈和更持久的免疫增强反应。
4.2 病毒样颗粒疫苗
PEDV 病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是一种和病毒结构相似的空心颗粒，基于 PEDV 的一种或多种结构蛋白（不含核酸）组装而成。与亚单位疫苗相比，VLPs 可以模拟病毒自然感染的过程，诱导免疫保护作用。同时，由于VLPs缺乏遗传物质，因此不存在自主复制的能力和毒力返强的风险，安全性更高。
近五年在猪体内进行过动物试验的猪流行性腹泻 VLPs 疫苗研究如表 6 所示。Lu 等将 PEDV S 蛋白的 B 细胞表位 748YSNIGVCK755重组到乙肝病毒核心衣壳蛋白（HBcAg）中制备 VLPs，在妊娠母猪分娩前 6 周进行 3 次肌肉注射，每次间隔 2 周；与对照组相比，所产仔猪的攻毒后存活率提升 30%，发病症状减轻。Hsu 等[46]以 PEDV VLPs（包含 S、M 和E 蛋白）为抗原，辅以 CCL25 和 CCL28 作为佐剂，免疫 4 周龄仔猪后能够检测到高水平的特异性 IgG 和 sIgA 抗体，并诱导了细胞免疫。ADDomer 是一种基于腺病毒多聚蛋白的纳米颗粒骨架，其与 BEVs 联合产生的 VLPs 疫苗表现出优异的免疫原性，具有巨大的开发前景。Du 等同时将 PEDV S 蛋白的 SS2 和 2C10 结构域以及 TGEV S 蛋白的 A 和 D 位点插入到 ADDomer 框架中，并通过 BEVS表达重组蛋白 AD、AD-P、AD-T 和 AD-PT，随后将自组装的重组 ADDomer-VLPs 制备成疫苗。临床结果表明，该重组 ADDomer-VLPs 疫苗能够有效刺激仔猪产生针对 PEDV 和 TGEV 的中和抗体以及 Th1 型和 Th2 型免疫反应。Trimer-Tag（蛋白质三聚体化）技术平台可以使任意一个目的蛋白三聚体化，获得稳定的类天然三聚体结构的病毒抗原，为开发VLPs提供了新的思路。该技术平台已通过新冠肺炎疫苗（SCB-2019）全面验证，SCB-2019 已在中国获得紧急使用授权。Li 等使用 TrimerTag 平台生产了 PEDV GS2022 毒株的 S1-Trimer、COE-Trime 和 RBD-Trimer 作为候选亚单位疫苗。妊娠母猪于产前 35 d 和 20 d 进行两次肌肉接种免疫，结果表明，与 RBD-Trimer和 COE-Trimer 相比，S1-Trimer 表现出优势。S1-Trimer 在妊娠母猪的血清、初乳和唾液中诱导高水平的 PEDV 特异性 IgG 和 sIgA 抗体，同时还诱导了细胞免疫，母猪 PBMC 中的IFN-γ 和 IL-4 的表达量显著升高，所产仔猪的血清和肠道样本中均检测到高水平的 IgG、IgA 和中和抗体。
4.3 重组活载体疫苗
重组活载体疫苗是基于同源重组原理研发的疫苗，将 PEDV 编码有效抗原蛋白的基因重组到活载体的基因组中并使之表达。活载体疫苗的安全性高，生产成本低，能够激发体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫。活载体的基因组能容纳足够的外源基因，可用于多联或多价疫苗的研制。研发重组活载体疫苗时，应注意载体安全性、外源基因表达量、重组菌/毒株遗传稳定性等问题。目前主要包括细菌活载体疫苗和病毒活载体疫苗。
4.3.1 细菌活载体疫苗
细菌活载体疫苗通常通过口服免疫，重组菌在体内可与病原体竞争肠道黏膜结合位点，起到免疫保护作用。目前常用的细菌活载体包括肠道乳酸菌和枯草芽孢杆菌。乳酸菌可以在胆汁和低 pH值条件下存活，因此可以保证重组菌在通过胃肠道过程中的免疫原性。此外，乳酸菌易于通过肠道吸收，有利于产生黏膜免疫。近五年在猪体内进行过动物试验的猪流行性腹泻细菌活载体疫苗研究如表 7 所示。Zang 等用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）表达 PEDV CH-SDBZ-1-2015 毒株的 S1 蛋白，构建了重组菌 L. acidophilus-S1，妊娠母猪口服免疫后，初乳中特异性 sIgA 抗体水平显著升高，可为新生仔猪提供良好的被动免疫。Zheng 等用约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）表达PEDV HLJ-2012 株 S 蛋白的中和表位 COE 区，从而构建了重组菌株 pPG-T7g10-COE/L.johnsonii，母猪口服免疫后在母乳中检测到高水平的 PEDV 特异性 IgG 和 sIgA 抗体，为仔猪预防 PEDV感染提供了有效保护。马茹梦以工程菌干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei393）、猪源副干酪乳酪杆菌(L. paracasei 27-2）、猪源罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus 16 reuteri J31） 和 猪 源 约 氏 乳 杆 菌 （L. johnsonii 6332） 为 宿 主 菌 ， 构 建 表 达 PEDVCH/HLJ/2019 毒株 S1 蛋白的四株重组菌株并将其口服免疫新生仔猪，结果表明重组猪源 L.paracasei 27-2 的益生性、抗逆性、遗传稳定性和免疫应答效果均优于其他三种重组菌，为构建更为有效的乳酸菌口服疫苗提供了科学数据。Guo 等用干酪乳杆菌（L. casei ATCC393）表达 PoRV 6Ds 蛋白、PEDV COE 蛋白和 TGEV VP4 蛋白，构建了重组乳酸菌 pPGT7g10-6Ds-COE-VP4/LC393，新生仔猪口服免疫后诱导了针对三种病毒的特异性黏膜免疫和体液免疫。此外，枯草芽胞杆菌作为活载体制备 PEDV 载体疫苗具有安全性高、免疫效果好等优点。Wang 等将 PEDV ZJ08 毒株的抗原表位 COE 重组至枯草芽胞杆菌（B.subtilis WB800）中获得重组菌 B. subtilis RC，口服免疫仔猪后显著提高了仔猪 CD3＋T 细胞的数量和 CD4＋/CD8＋T 细胞的比率，并检测到高滴度的特异性 IgG 和 sIgA 抗体水平。
4.3.2 病毒活载体疫苗
由于病毒活载体本身有助于增强免疫应答，并且可以携带多种外源基因片段，因此被认为是一种理想的疫苗研发载体。近五年在猪体内进行过动物试验的猪流行性腹泻病毒活载体疫苗研究如表 8 所示。腺病毒(adenovirus，AdV)是最常用的病毒活载体。AdV 具有非整合性的表达基因和转导能力，因此被广泛用于表达外源抗原的疫苗开发。Do 等构建了编码 LTB 和 PEDV COE 的重组腺病毒 rAd-LTB-COE，对 3 周龄仔猪进行肌肉注射或口服免疫后均可诱导高水平的体液免疫和细胞免疫。Wang等构建了表达特异性靶向 PEDV SH2012-5 株 N 蛋白的单链可变片段（single-chain variable fragment，scvFs）的重组腺病毒 rAdV-ZW1-16、rAdV-ZW3-21、rAdV-ZW1-41 和 rAdV-ZW4-16，3 日龄仔猪口服免疫后显著抑制了 PEDV 诱导的促炎细胞因子的表达，恢复了 IFN-λ 的表达水平，在仔猪受到 PEDV 强毒株的攻击后可以起到保护作用，为后续开发基于单链抗体的疫苗提供了基础。Liu 等用 AdV 表达 PEDV CH/HBXT/2018 株的 S 蛋白，构建了重组病毒rAd-PEDV-S，对 4 周龄猪进行两次肌肉注射后诱发了特异性体液免疫反应，可以在仔猪受到 PEDV 强毒株的攻击时起到保护作用，保护率为 40%（2/5）。Song 等构建了表达PEDV/CH/TP-4-4/2018株 S蛋白的重组腺病毒 rAd5-PEDV-S，设计了在妊娠母猪分娩前 5周和2周进行两次肌肉接种以及在分娩前5周进行单次肌肉接种的两种免疫程序。结果显示，通过这两种免疫程序引起的 IgA、IgG 和 NAb 滴度的差异并不显著，这可能是因为 rAd5-PEDV-S 免疫的猪体内已经存在抗腺病毒的抗体，表明在分娩前 5 周给母猪进行单次 rAd5-PEDV-S疫苗接种也可能是一种可行的免疫方案。目前，大多数 PEDV商业疫苗都推荐在母猪分娩前 5 周和 2 周进行两次免疫接种，Song 等的这一发现对减少母猪免疫应激具有重要意义。
水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）是一种有潜力的外源表达病毒载体，已被用作构建人用疫苗的平台。Ke 等以 VSV 为载体表达 PEDV/CHN/SHANGHAI/2012株的 S 蛋白，获得了重组病毒 VSVMT-SΔ19，对妊娠母猪进行 2 次肌肉注射后，妊娠母猪和所产仔猪（5日龄）血清中均含有针对 PEDV G2b 型的中和抗体；但作为活疫苗对母猪进行滴鼻免疫后在血清中没有检测到中和抗体，推测原因可能是 S 蛋白未在宿主细胞中表达或抗原表位未被抗原呈递细胞获取。Wang 等以猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）C 株表达了PEDV GX750A 毒株的S1N 和 COE 结构域，构建了重组病毒 vC/SM3’UTRNCARD/tPAsS1NCOE，对 5 周龄仔猪肌肉接种后可诱导产生同时针对 CSFV 和 PEDV 的高免疫应答，并具有对抗 CSFV 和 PEDV 强毒感染的保护作用，有望在临床上达到一针两防的免疫效果，从而减少猪群免疫次数。
TGEV、PoRV 和 PEDV 都是引起仔猪腹泻疾病的冠状病毒。Li 等构建了表达 PoRV VP7 蛋白的重组 PEDV 病毒 rPEDV-PoRV-VP7，接种 10 日龄仔猪后，在其唾液中检测到针对 PoRV VP7 蛋白和 PEDV S 蛋白特异性 sIgA 抗体，表明该疫苗可以有效诱导黏膜免疫反应，为开发 PEDV和 PoRV的二联疫苗提供了思路。Pascual-Iglesias等构建了表达 PEDV-1718NVSL 株 S 蛋白的重组 TGEV 病毒 rTGEV-RS-SPEDV，三周龄仔猪口服接种后诱导了针对PEDV 的特异性体液免疫反应，可以保护仔猪免受 PEDV 强毒株的攻击，但 TGEV 抗体检测为阴性。
4.4 转基因植物疫苗
转基因植物疫苗是将 PEDV 主要保护性抗原基因整合到植物细胞基因组中形成转基因植物，利用植物作为生物反应器大量表达外源蛋白，将外源蛋白作为疫苗或将转基因植物直接加工饲喂动物使其获得免疫。近五年在猪体内进行过动物试验的猪流行性腹泻转基因植物疫苗研究如表 9 所示。Ho 等用本氏烟草表达 PEDV PS6 株的 COE/G2a-p2 蛋白，肌肉注射妊娠母猪后，可在所产仔猪 5日龄时检测到高水平 IgG、COE-IgA、中和抗体和 IFN-λ，并可以保护仔猪免受 PEDV 强毒株的攻击。Sohn 等[68]用本氏烟草表达融合了猪 Fc 结构域（pFc2）的 PEDV S1 蛋白，妊娠母猪在产前 6 周和 2 周进行两次肌肉注射免疫，可在母猪的初乳和血清中检测到高水平的中和抗体，对哺乳仔猪的保护率达 80%。尹国友[69]将PEDV HeNPEDV-01 株的 S1 基因导入到番茄中，给仔猪口服转基因番茄后可刺激机体产生免疫应答从而有效保护仔猪。Egelkrout 等将 PEDV Colorado/2013 毒株的 S 蛋白与不耐热肠毒素 B 亚基和树突状细胞肽融合后转化至玉米中，检测到目的抗原蛋白表达量可以达到20 mg·kg−1，仔猪口服转基因玉米后可产生高水平的血清中和抗体。
转基因植物疫苗具有成本低廉、稳定性好和便于贮存等优点。同时，转基因植物疫苗的抗原蛋白可作为口服疫苗或饲料添加剂，便于大规模免疫应用，具有广阔的发展前景。但是目前抗原蛋白在转基因植物中的表达量通常较低，且由于动物个体摄入量不一，免疫效果不易保障，因此未来还有待继续发展。
5 核酸疫苗
核酸疫苗是将编码 PEDV特异性抗原蛋白的外源基因（DNA或 RNA）直接导入宿主细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白以诱导宿主产生针对该抗原蛋白的特异性免疫应答。核酸疫苗包括 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗。现有在猪体内进行过动物试验的猪流行性腹泻核酸疫苗研究如表 10 所示。DNA 疫苗以质粒为载体表达抗原基因，免疫时以重组质粒的形式直接注射到宿主体内，或先将质粒转化至载体菌内，依靠载体菌将疫苗质粒导入宿主细胞。Yin 等用 pPI-2.EGFP 载体构建了共表达 PoRV VP7 基因和 PEDV S 基因的 DNA 疫苗 pPI-7.EGFP.VP7.S，经肌肉注射免疫小鼠后诱导了抗 S 蛋白和 VP7 蛋白的特异性免疫应答。Zhang 等用鼠伤寒沙门菌（S. Typhimurium aroA）SL7207 构建了共表达TGEV SC-H 毒株和 PEDV SC-L 毒株 S 基因的 DNA 疫苗 pVAXD-PS1-TS，20 日龄仔猪口服免疫后可有效刺激针对 TGEV 和 PEDV 的体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫。相比 mRNA 疫苗，DNA 疫苗更加稳定，制备方法也更加简单，但重组质粒具有整合到宿主细胞基因组中的风险。其次，DNA 疫苗目标蛋白的表达需要经过复制、转录和翻译等多个步骤才能产生免疫原，这导致目标蛋白的表达效率相对较低，限制了 DNA 疫苗的进一步发展。
相对于 DNA疫苗，mRNA疫苗只能实现一轮感染，不具备连续感染能力，从而减少了与宿主细胞基因组整合的风险。但 mRNA 疫苗通常需要借助额外的载体进行递送，如脂质20纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）和复制缺陷型病毒颗粒。2014 年 6 月，美国批准了一款用于紧急接种的 PEDV mRNA 疫苗（PED-RP），PED-RP 是将 PEDV S 基因连接到pVEK载体中制备而成，pVEK是基于复制缺陷型的委内瑞拉马脑炎病毒开发的一种载体。此外，PED-RP 也是美国第一个用于预防 PEDV 的 mRNA 疫苗。2020 年，在菲律宾某猪场开展了针对该疫苗的免疫效力试验，结果表明该疫苗能够促进母猪初乳和常乳中中和抗体、IgG 和 sIgA 的产生，从而给仔猪提供有效的保护。杨利敏等选择 PEDV NB-F71 毒株的 RBD 结构域作为疫苗靶抗原，制备了基于 RBD 单体和二聚体的 mRNA 疫苗，妊娠母猪产前 7 周先免疫弱毒疫苗，4 周后分别免疫 RBD-D mRNA 候选疫苗或灭活疫苗，结果表明mRNA 和灭活疫苗诱导的中和抗体平均滴度分别达到 531.8 和 464.8，无显著性差异，提示mRNA 疫苗可诱导与灭活疫苗相近的抗体水平。Zhao 等设计了用 LNPs 封装的 mRNA（mRNA-LNP）疫苗，编码 PEDV AH2012/12 株的 S 蛋白。临床试验结果表明，3 日龄仔猪肌肉接种疫苗后，可诱导产生特异性 IgG 和 sIgA 抗体，且免疫后 3 个月内 IgG 抗体仍保持相对较高的水平，同时还能够激活细胞免疫应答；妊娠母猪免疫后，母猪血清和初乳中的特异性 IgG 和 sIgA 抗体滴度显著增加，并能在仔猪血清中检测到 IgG 与 sIgA 抗体，为仔猪提供了良好的被动免疫。
核酸疫苗属于第三代疫苗，同时具备亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的时效性，能够更好地刺激机体的免疫应答。同时，核酸疫苗的研发生产周期相对较短，当病原体发生变异时只需要替换相关的基因序列就能够快速地制备新疫苗。这些特点在新冠 mRNA疫苗的成功应用中得到了体现，随着 mRNA 技术的不断发展和产业链的完善，核酸疫苗有望在未来成为兽用疫苗领域的主力军。
6 对未来的展望
传统的灭活疫苗具有安全性好、无毒力返强风险、制品稳定、便于保存运输等优点；弱毒疫苗具有免疫作用快、免疫期长、适用于多种免疫途径等优点，因此被广泛用于临床预防PEDV。随着高致病性 PEDV 变异株的出现，传统疫苗的效果逐渐受到挑战。因此，提高灭活疫苗的有效抗原含量以及平衡弱毒疫苗的有效性和安全性成为加强传统疫苗免疫保护效力的关键。虽然基因工程技术的发展为新型 PEDV 疫苗的研发提供了新的思路和平台，但由于安全性、生产成本、免疫保护效果和研发周期等限制因素，基因工程疫苗在实验室走向临床应用还需要时间。在新冠疫情暴发后，mRNA 疫苗作为备受关注的疫苗类型，为未来研发 PEDV 疫苗提供了新的途径和思路。
PEDV 是一种肠道感染的病毒。相比于刺激机体产生血清 IgG 抗体，刺激肠道免疫产生的 sIgA 抗体更能有效保护仔猪。因此，未来 PEDV 疫苗的研究重点应放在如何刺激肠道免疫以诱导 sIgA 抗体的产生以及对 sIgA 抗体水平的快捷评估。PEDV 的蛋白结构与功能挖掘、致病与免疫机制解析有助于为 PEDV 疫苗和抗病毒药物的研发提供新的靶点，并为通用性冠状病毒疫苗的研发提供新的策略。此外，优化不同类型疫苗的组合使用、创新免疫接种方式和建立现代化疫苗技术平台都有助于提高现有疫苗的免疫效果。随着不断的科学推进和技术发展，我们有望看到更多 PEDV 疫苗研究技术的突破，从而保障养猪行业的健康持续发展。返回搜狐，查看更多
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